为夜行鼠类，除秋季储粮季节，白天一般不出洞活动。
黑线仓鼠比金黄地鼠小一些，一般在28～40克，大的可达55克，体长90毫米，尾长13毫米左右。口腔左右两侧有颊囊，眼大呈黑色。雄鼠睾丸很大，长13毫米左右，位于尾根部明显突出，阴茎至阴囊距离25～30毫米。多数雌鼠有4对乳头。黑线仓鼠染色体大，数量少(2n=22)，且易于相互鉴别，在小型哺乳动物中是难有可贵的。黑色仓鼠无胆囊，输胆管直接开口于十二指肠。
黑线仓鼠昼伏夜行，善于筑巢，行动不敏捷，运动时腹部着地，当受到外界刺激而兴奋时发出激烈的叫声。雌鼠力气比雄鼠大，但不常主动攻击和追逐雄鼠，除了发情期以外，雌鼠不让雄鼠接近。背部被毛呈灰褐色，背部有一条黑线，腹部呈白色。
杂食性，主食种子，也食植物绿色部分，还吃小量昆虫。在内蒙古草原常见的35种植物中，最喜食的有苜蓿、草木樨等7种，平均日食鲜草量为11g(折干草4g)。在河南，平均日食种子量为8g。
栖息环境十分广泛，遍及草原、山地、平原农田、疏林等各种生境。在农田和栽培草地中，常在田埂打洞，以路基、堤坡和田间撩荒地数量最多。
多数在田间打洞营巢，也有利用其他鼠的废弃洞。洞穴分临时洞、贮粮洞和栖息洞三种类型。临时洞供临时躲避用，1～2 个洞口，洞道长20～50cm，有简单巢。贮粮洞内有仓库.可见到粮油种子、草籽等，洞口3～4个。栖息洞较复杂，内有巢、仓库、厕所和废弃的旧盲道，洞道较长。
